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幾種細菌芽孢染色方法的對比分析

來源:原創論文網 添加時間:2019-09-04

  摘    要: 通過研究幾種細菌芽孢染色方法, 對不同方法的優缺點進行比較, 根據實際的實驗室條件和諸多因素, 本著方法簡易、結果可靠、學生易掌握、成功率高、環保安全等原則, 選出適合教學和科研應用的芽孢染色方法。

  關鍵詞: 芽孢; 染色; 明顯; 安全;

  Abstract: By studying several methods of bacterial spore stain and comparing the advantages and disadvantages of different methods, according to the actual laboratory conditions and many factors, on the basis of simple method, reliable results, easy to master, high success rate, environmental protection and security some suitable spore stain methods were selected for teaching and research application.

  Keyword: spore; dyeing; obvious; security;

  芽孢(endospore)是一些革蘭氏陽性細菌在生長發育后期形成的休眠保護結構,芽孢的著生位置、形狀、大小等因素對細菌有分類學意義[1]。芽孢染色法也是微生物學實驗教學和相關科研的一個最基本的實驗技術。而芽孢的結構非常復雜,用常規的染色方法很難將其染上顏色。芽孢的染色方法至少有Schaeffer-Fulton法、改良的Schaeffer-Fulton法、Bartholomew-Mittwer法、Moeller法、改良Moeller法、Modified Ziehl-neelsen法、Abbott方法、Doner法及改良Doner法等。初染劑主要有孔雀石綠、石炭酸復紅、美藍。復染劑有沙黃、堿性復紅、美藍等。但每種方法都有一定的優缺點。筆者從事多年微生物學實驗教學與研究,對細菌芽孢染色法做了一些改進和探討,對在實驗教學和科研中采用的幾種芽孢染色方法的比較和研究進行總結。

  1、 材料和方法

  1.1、 材料

  (1)菌種:解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens strain-114)斜面 (由本課題組分離并保存) ,牛肉膏蛋白胨培養基,37℃培養,48h。

  (2)試劑:5%孔雀石綠,飽和5%孔雀石綠,0.5%沙黃染液,石炭酸復紅染液,堿性復紅,0.1%呂氏美蘭等,冰乙酸等。

  (3)設備:Nikon90i顯微鏡。

幾種細菌芽孢染色方法的對比分析

  1.2、 方法參考[2,3,4,5,6,7,8,9,10]文獻,選擇并設計以下幾種方法。

  方法1:Schaeffer-Fulton法;

  方法2:改良Schaeffer-Fulton法;

  方法3:Schaeffer-Fulton冷染法, 滴加一滴無菌水于潔凈載玻片上,挑菌涂布,干燥,經火焰來回20次熱固定,飽和的孔雀石綠室溫下覆蓋染色15min以上,水洗后用0.5%的番紅染液染色60S,吸水紙附上吸干多余的番紅染液,水洗,干燥后顯微鏡觀察;

  方法4:一滴冰乙酸滴于潔凈載玻片上,挑菌涂布,干燥3min,固定,石炭酸復紅染液覆蓋3min, 水洗,滴加0.1%呂氏美蘭染液覆蓋2min,水洗,干燥后顯微鏡觀察;

  方法5:一滴無菌水滴于潔凈載玻片上,挑菌涂布,干燥,固定,10倍稀釋石炭酸復紅染液覆蓋并微火加熱至冒蒸汽,保持5min,注意適時添加染液防干,水洗,滴加0.1%呂氏美藍染液覆蓋2min, 水洗,干燥后顯微鏡觀察;

  方法6:一滴無菌水滴于潔凈載玻片上,挑菌涂布,干燥,經火焰來回20次熱固定,飽和孔雀石綠覆蓋至少15min,水洗,石炭酸復紅染液覆蓋2min, 水洗,干燥后顯微鏡觀察。

  圖 (1-6) 不同方法芽孢染色觀察圖片 (1000倍放大)
圖 (1-6) 不同方法芽孢染色觀察圖片 (1000倍放大)

  2 、結果

  六種染色方法結果見圖(1-6),實驗結果顯示:用不同Schaeffer-Fulton法的芽孢染色 (圖1、2、3) 結果中菌體顏色偏橙紅,與芽孢的綠色對比效果比較明顯,結果容易觀察,不管是加熱載玻片 (圖1) 或者沸水浴法 (圖2) 等加熱方法,還是室溫冷染法 (圖3) ,都可以達到較好的效果;圖4、5為石碳酸復紅初染劑美藍為復染劑的結果,實驗結果顯示,紅和藍色的對比不明顯,難以輕松區分芽孢和菌體細胞,而且乙酸干燥時非常快,需要添加2-3次,不好把握和操作。而且石碳酸具有明顯揮發性,對人體皮膚、黏膜具有明顯刺激,在使用石碳酸加溫促染時會感覺到眼睛和鼻部的不適。圖6為方法6的結果,將復染劑沙黃改為石碳酸復紅,菌體染色淡紫紅色,與芽孢的綠色對比明顯,效果較好,且感官漂亮。

  3、 討論

  (1)對于本文所述的方法1、2、3三種方法中,冷染法染色效果不次于前兩種加熱法,而且對學生在實驗室操作有諸多好處:首先冷染不會產生蒸汽,而加熱方法均無法減少因操作中加熱帶來的染料揮發而產生的孔雀石綠熱蒸汽,孔雀石綠具有高毒、高殘留、致癌、致畸等作用,會造成環境的污染和危害實驗中的學生和老師的健康;同時由于加熱或沸水浴產生的蒸汽使實驗室環境潮濕,影響實驗過程中放置在實驗臺上的顯微鏡,容易造成顯微鏡鏡頭長霉,難以保養修復,影響觀察并降低了顯微鏡的使用壽命;同樣不用加熱的方法也減少酒精燈或電爐等的使用,利于節能和環保,也有利于實驗室安全。

  對于方法4和5,實驗結果顯示,紅藍的對比沒有紅綠的對比明顯,并且筆者也曾嘗試了不同的試劑濃度和染色時間的比較,難以得到明顯的結果,方法4中雖然避免了加熱對染色劑的揮發,但用乙酸替代水,涂片干燥時非常快,需要添加2-3次,不好把握和操作。石炭酸對人體皮膚、黏膜具有明顯刺激作用,方法5中由于需要對石碳酸復紅染液加熱,加溫促染促進了石碳酸的揮發,操作者會感覺到眼睛和鼻部的不適。由于結果對比不明顯以及染液的不安全性,所以實驗教學中不建議采用方法4和5。

  方法6將復染劑沙黃改為石碳酸復紅,并且采用冷染法,菌體淡紫紅色,與芽孢的綠色對比明顯,效果較好,感官漂亮,而且沒有加溫促染導致的大量有毒蒸汽。

  (2)我校微生物實驗課面向生物工程、食品科學與工程、生物技術、水產養殖、藥物制劑、海洋科學等9個專業,以往用Schaeffer-Fulton法的芽孢染色實驗課結束,不僅酒精燈、實驗臺等沾上很多染料,實驗室里也產生了很多的孔雀石綠有毒蒸汽或水蒸汽。

  所以,綜合考慮,我們目前采用的教學方法是方法3和方法6,并且將芽孢染色觀察實驗和革蘭氏染色觀察兩個實驗項目安排在一個下午完成,引導學生先完成芽孢桿菌革蘭氏染色后留意觀察少數形成的無色芽孢,然后再觀察用方法3或方法6完成的芽孢染色涂片,取得了較好的實驗效果,由于這兩種芽孢染色方法都是冷染法,需要初染的時間比較長一些,同學們在芽孢初染等待的時間去完成革蘭氏染色實驗和觀察,這樣統籌利用時間,提高課堂的效率。實踐顯示,這兩種方法簡便易行、有效、結果明顯,更適于在實驗教學中應用,并且也比較環保和安全。

  參考文獻

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